Colegio Inglés Saint John
Departamento de Ciencias/Juan Valenzuela Pérez/jvp
GUÍA DE ESTUDIO
“Diferenciación Celular”
BE42G
INTRODUCCIÓN
La mosca del vinagre (Drosophyla melanogaster) presenta un desarrollo que dura sólo unos días después de la fertilización. Sin embargo, por efecto de mutaciones, existen dos especies mutantes en este insecto; una especie presenta dos pares de élitros en vez de uno solo, siendo ambos pares totalmente funcionales; la otra presenta el par de antenas más larga que lo normal, dando la apariencia de un cuarto par de patas. ¿Cómo se produce este fenómeno? La respuesta está en el concepto general de fenotipo y en los requerimientos para la generación de distintos fenotipos en las células de un organismo. Al respecto conviene considerar la función de un grupo particular de genes denominados homeóticos, los cuales definen el eje antero-posterior del cuerpo y la posición de los órganos que se desarrollarán a lo largo de este eje.
Genes y Desarrollo Embrionario
El desarrollo embrionario es un proceso de cambio progresivo durante el cual un organismo va adquiriendo las formas sucesivas que caracterizan su ciclo de vida. El desarrollo embrionario se refiere a las etapas más tempranas que definen el fenotipo característico de la especie. Los procesos que ocurren a escala celular no sólo incluyen la proliferación y el crecimiento celular sino también la diferenciación celular y la morfogénesis. La diferenciación es la generación de especificidad celular, es decir, la determinación de estructuras y funciones específicas en distintos fenotipos celulares (Fig.1). Dentro de cada especie, las etapas de la construcción del embrión se suceden siguiendo un escenario constante. El programa genético dirige las etapas del desarrollo, la estructuración del embrión y la diferenciación de los distintos órganos, cuyas células (musculares, nerviosas, epiteliales, etc.) expresan sólo una parte del programa genético completo.
Dos tipos de genes definen el tipo de órgano y su localización en cada especie. Ciertos genes definen la naturaleza del órgano (pata, oído, ojo, etc.) mientras que otro tipo de genes determina el lugar específico donde han de actuar. Antes que la mayoría de las células comience a especializarse, se establece un plan corporal que define la ubicación de las principales regiones del cuerpo: cabeza, tronco, cola, etc. Las anomalías que se indicaron en la introducción con respecto a los mutantes de Drosophyla afectan sólo a los genes que determinan la ubicación de las alas, en un caso, y las patas en otro; el primero se denomina mutante bitórax, en tanto que el segundo se denomina mutante antennapedia (Fig.1). Los genes involucrados en estas aberraciones se denominan genes homeóticos y sus mutaciones son mutaciones homeóticas. Un gen homeótico es un gen que interviene en el programa de desarrollo que determina la localización de órganos a lo largo del eje antero-posterior. La determinación de este eje cabeza-cola del embrión constituye la piedra angular del desarrollo porque proporciona una línea central a lo largo de la cual se desarrollará el resto de las estructuras. Los genes homeóticos constituyen una familia de genes que determina la forma del cuerpo. Son genes de posición o selectores de posición de las estructuras que se desarrollan. Expresan su actividad en regiones diferentes del embrión, subdividiéndolo a lo largo del eje cabeza-cola en campos celulares con diferentes potenciales de desarrollo, que se transformarán en miembros y otras estructuras. Esta subdivisión del cuerpo embrionario precede a la formación de órganos o estructuras específicos (Fig.2).
Una mutación homeótica provoca la sustitución de una parte del cuerpo por una estructura cuya ubicación normal correspondería a otro sitio. En la fig. 1 las moscas mutantes bitórax tienen un par de alas adicionales en el sitio donde normalmente deberían estar unos pequeños apéndices llamados estabilizadores o balancines; los mutantes antennapedia tienen patas adicionales en el lugar donde deberían tener antenas. ¿Cómo es posible que la mutación de uno o dos genes produzca una transformación fenotípica tan notable como la aparición de un órgano completo en un sitio que no corresponde? Se necesitan cientos de genes activos para crear las alas y las patas con ubicación normal. Los genes homeóticos actúan como genes “rectores” o “maestros”, ya que dirigen la actividad de varios genes subordinados. Por ejemplo, en Drosophyla sólo existe un gen homeótico que dirige la formación del ojo, para lo cual debe regular la expresión de alrededor de los 2500 genes que codifican a las proteínas que dan función y estructura al ojo. De esta manera un solo gen homeótico funciona como un gen maestro capaz de controlar toda la cascada de eventos necesarios para el desarrollo de una estructura tan compleja como el ojo.
¿Qué tipo de proteínas codifican los genes homeóticos? El producto de los genes homeóticos son proteínas reguladoras de genes. Los genes homeóticos tienen una secuencia muy poco variable llamada caja homeótica, que en la proteína da origen a una región llamada homeodominio, cuya función consiste en reconocer y unirse a secuencias de ADN en los genes subordinados. Las proteínas con homeodominios activan o reprimen los genes subordinados.
Los genes homeóticos inicialmente encontrados en Drosophyla han sido encontrados posteriormente en vertebrados y en numerosos otros invertebrados. Cuando se comparan los genes homeóticos de la mosca con los del ratón se encuentran grandes homologías de secuencias. Esto hace pensar que durante la evolución los insectos y los vertebrados heredaron genes homeóticos desde un ancestro común. Esto explicaría el patrón de organización ampliamente difundido que se observa en un gran número de especies, donde los órganos y los aparatos principales aparecen distribuidos en tres ejes de polaridad: el eje antero-posterior, el eje dorso-ventral y el eje derecha-izquierda. Esta organización es compartida por todos los vertebrados: aves, anfibios, reptiles y mamíferos. El hecho que estos genes compartan una secuencia llamada caja homeótica (homeobox) sugiere que el mecanismo que determina la cabeza, el tronco y la cola pueden haber surgido una sola vez en la evolución.
Los genes homeóticos se ubican en complejos o grupos dentro de un cromosoma. La ubicación de uno de estos genes en un cromosoma tiene una correspondencia con el lugar donde se expresa en el cuerpo. En la Figura 2, en un experimento de laboratorio, se marcaron los genes con caja homeótica de Drosophyla y de ratón y las regiones del plano corporal que estos genes controlan. En la molécula lineal del ADN, estos genes con cajas homeóticas están dispuestos en un orden preciso de izquierda a derecha. Los genes con cajas homeóticas situados a la izquierda de un complejo de estos genes se expresan en las regiones posteriores del cuerpo, mientras que los genes situados más hacia la derecha se expresan más cerca de la cabeza. Este es un principio general. Se observa en vertebrados y en la mosca de la fruta. Es decir, en el ADN cromosómico, los genes con cajas homeóticas se disponen en el mismo orden inverso en el que se expresan a lo largo del eje antero-posterior del cuerpo:
ADN A B
COMPLEJO HOMEÓTICO C
Relaciones entre estructura y función en diversos fenotipos celulares
En este punto conviene resaltar que la composición proteica de las células es distinta y que esto tiene que sustentarse en la expresión de un conjunto de genes distintos, según el fenotipo. Recordemos que las células especializadas tienen una morfología que las distingue y expresan proteínas involucradas en funciones bioquímicas particulares relacionadas con funciones particulares de cada tipo celular (Fig.3).
Planteemos las siguientes interrogantes:
¿Cómo es que a partir de una célula se generan más de un ciento de fenotipos diferentes en el organismo?
¿Cómo es posible que en un mismo genoma algunos genes se encuentren apagados mientras otros se expresan activamente?
¿Qué eventos van ocurriendo para diferenciar las células durante el desarrollo?
El resultado de la diferenciación celular es una diferencia cuantitativa y cualitativa en la expresión de genes distintos, controlada en su mayor parte al nivel de la transcripción. Revisemos los alcances del siguiente experimento indicado en la Fig. 4 sobre la síntesis diferencial de distintos ARN mensajeros en distintos tejidos. Durante la incubación de núcleos con el precursor radioactivo del ARN se transcriben alrededor de 300-500 nucleótidos. El ARN marcado radiactivamente durante la transcripción es luego capturado por hibridación con el ADN clonado (cADN) de un gen específico. Así se puede saber el nivel de transcripción comparativamente con otros genes. Los ARN transcritos por el núcleo de células hepáticas pero no los de otros tejidos hibridizan con los cADN que codifican proteínas que se encuentran en el hígado. Con este experimento se consideran dos conceptos:
1. las diferentes células expresan diferentes genes.
2. debe haber control de la transcripción.
Por lo tanto, la mayor parte de la regulación génica ocurre a nivel transcripcional. Durante el desarrollo, las células responden a los cambios que se producen en las señales de comunicación entre células y en las interacciones entre células cambiando sus patrones de expresión de genes. Vemos que se forman órganos con conjuntos de células que cumplen funciones similares. Sin embargo, cabe hacerse las siguientes preguntas:
¿Cómo se relacionan los eventos que ocurren en la superficie celular con la transcripción que ocurre en el núcleo?
¿Cómo se reconocen entre sí las células para formar órganos?
Las respuestas a las preguntas anteriores están ligadas a la existencia de receptores de señales en la superficie celular que se conectan funcionalmente con el núcleo y elementos de regulación de la transcripción que responden a esas señales. También están ligadas a la existencia de moléculas de adhesión entre células que forman órganos.
Modelos de Diferenciación Celular
El músculo esquelético de mamíferos es un buen modelo para explicar el proceso de diferenciación celular, el cual ha revelado algunos principios básicos que permiten intuir la existencia de procesos similares en otros sistemas celulares. El estudio de los programas de diferenciación y desarrollo de órganos en distintos organismos han demostrado que dependen de combinaciones de factores que regulan la expresión de genes específicos de una manera sensible a las interacciones de las células con el medio. Estas interacciones involucran señales y receptores de señales producidas por otras células del entorno.
En mamíferos, la miogénesis esquelética se produce a través de tres estados (Fig.5). En el primer estadio surgen los mioblastos a partir de bloques de células mesodérmicas llamadas somitos, que se encuentran a ambos lados del tubo neural en el embrión. Los somitos también dan origen al esqueleto y al tejido conectivo de la piel. Señales específicas provenientes del tubo neural y del ectoderma lateral juegan un papel importante en determinar la formación de los mioblastos en los somitos.
Los mioblastos ya están determinados a formar músculo, pero aún no se han diferenciado. Si se cultivan fuera del embrión se les puede hacer diferenciarse en músculo esquelético. En el embrión un subconjunto de mioblastos recibe señales transitorias que los hacen migrar hacia otras regiones donde terminan formando los músculos de las extremidades. Otros mioblastos no migran y se quedan en la región dorsal del embrión donde forman los músculos del tronco.
En la región donde se formarán las extremidades se alinean los mioblastos que migraron, dejan de proliferar y se fusionan entre ellos para formar un sincicio (una célula que contiene múltiples núcleos) que finalmente se diferencia en músculo. Esta célula de músculo esquelético multinucleada se llama miotubo. Simultáneamente con la fusión celular se produce un dramático incremento en la expresión de los genes necesarios para la formación y función del músculo. El ejemplo muestra que una subclase de células de los somitos debe haber recibido señales que las indujo a migrar y luego a expresar genes importantes para dirigir la diferenciación hacia células musculares. El hecho que la diferenciación ocurra en un sitio específico del embrión, aún cuando las células ya están determinadas a la diferenciación, indica que existen factores que impiden que el proceso ocurra en un lugar inadecuado.
Entre los genes que se han descubierto como importantes para dirigir el proceso de diferenciación están los llamados mioD y miogenina que codifican proteínas capaces de regular la expresión de genes de actina, miosina y otros genes importante en el fenotipo muscular esquelético.
Algunos años atrás se realizó el experimento que llevó a descubrir los genes involucrados en la diferenciación celular (Fig.6). La línea celular fibroblástica llamada C3H 10T1/2 puede convertirse en célula muscular cuando se incuba con un inhibidor de la metilación del ADN, la 5-azacitidina. En este proceso las células cambian de formas y se hacen contráctiles. Esto se puede observar en el microscopio de luz. Es necesario señalar que ciertas enzimas llamadas metilasas son capaces de introducir un grupo metilo en las citocinas del ADN y que esta modificación es un mecanismo general para impedir la expresión de genes. Las regiones del ADN donde la transcripción es escasa tienen mayor contenido de citosina metilada. En el experimento, la 5-azacitidina inhibe la metilación del ADN y por lo tanto los genes que antes se encontraban apagados por la metilación ahora se activan. En estas condiciones, los fibroblastos se convierten en células musculares. Estos hechos proveen un modelo para buscar los genes que se activaron. Revisemos las etapas del procedimiento para detectar los genes involucrados en la diferenciación (Fig. 6). Primero, se observó que el ADN de la célula con 5-azacitidina (que se llamó azamioblasto) era capaz de inducir la diferenciación cuando se introducía en fibroblastos no tratados con el inhibidor de la metilación del ADN. Luego, se realizó el experimento para detectar los ARNm expresados adicionalmente en los fibroblastos tratados con 5-azacitidina. El procedimiento consiste en generar cADN a partir de los ARNm mediante transcripción reversa. Estos cADN se hibridizan con los ARNm de las células no tratadas de manera que sólo los cADNs correspondientes a los genes que se expresan después del tratamiento (transfección con cADN) quedan sin hibridizar y se pueden utilizar para rastrear una librería de cADNs de mioblastos. Una vez aislados los cADNs de los mioblastos se procedió a probarlos en ensayos de diferenciación, transfectándolos en los fibroblastos. Como se observó en el experimento, la transfección provoca la diferenciación de estas células en mioblastos, indicando que el cADN transfectado codifica para una proteína importante en la regulación del proceso de diferenciación, que en este caso se llamó mioD. De manera parecida se han identificado y clonado otros genes importantes para esta diferenciación.
Comunicación Intercelular
La importancia de las interacciones celulares locales en el desarrollo se puede apreciar en el experimento de transplante del primordio óptico (conjunto de células que darán origen al ojo) hacia un sitio en el ectodermo que normalmente no da origen al lente del ojo (Fig. 7). El transplante induce en esa zona ectópica la formación del lente en las células del ectoderma. Se denomina inducción al proceso por el cual una población de células influencia el desarrollo de células vecinas. Esto se debe a señales producidas por unas células e interpretadas por otras. Entre las señales se encuentran factores de crecimiento tales como la familia del factor de crecimiento transformante b que participa en el desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados. Estos factores promueven la producción de moléculas de adhesión celular, de otros factores de crecimiento y de moléculas de la matriz extracelular, que serán estudiados más adelante.
Las interacciones entre células cumplen un papel crucial en el desarrollo de órganos internos, tales como riñón, pulmón y páncreas. En el riñón ocurren interacciones recíprocas que inducen diferenciación entre diferentes células. (Fig. 
Es un ejemplo de comunicación entre células, un verdadero diálogo en que las señales de unas células inducen a las otras células a producir otras señales, frente a las cuales responden ahora las primeras células.
Debemos recordar que un epitelio es una capa continua de células cuya superficie se encuentra dividida en dos regiones: una región apical y una región basolateral separadas por las uniones estrechas, que impiden el flujo de iones y la difusión de las distintas proteínas que se encuentran en estas dos regiones.
Las células epiteliales derivan de una de las tres capas germinales, ya sea del ectodermo, mesodermo o endodermo. En contraste, el mesénquima contiene células asociadas más laxamente y no polarizadas, que derivan ya sea del mesodermo o ectodermo. La formación de órganos como el riñón, intestino, páncreas y pulmón, es regulada por las interacciones entre las células epiteliales y las mesenquimáticas. Estas interacciones incluyen una serie de eventos de inducción recíproca.
En la organogénesis nefro-urinaria, las células del mesénquima inducen la formación de ramificaciones de las células epiteliales del brote uretral que se diferencian en los túbulos colectores del riñón (Fig. . A su vez, el epitelio de los túbulos colectores induce a las células mesenquimática a formar, primero, una condensación celular, que luego deriva en células epiteliales que darán origen a los túbulos proximales y distales y también al glomérulo. En estos procesos de morfogénesis renal participan un gran número de señales solubles, incluyendo proteínas de la familia del factor de crecimiento transformante b, y también señales ancladas a la superficie celular (Integrinas). Algunas señales son expresadas por el epitelio mientras otras son producidas por las células del mesénquima. También participan receptores específicos de estas señales.
En resumen, es necesario señalar que ciertas señales extracelulares transitorias son capaces de inducir un programa de diferenciación célula-específico que incluye la expresión de factores capaces de regular la expresión de genes específicos, mientras otras señales lo inhiben de manera que ocurra en el tiempo adecuado.
Células Troncales
En algunos tejidos, como el hígado, frente a daño traumático o por drogas, se producen células diferenciadas de reemplazo por simple proliferación de células previamente diferenciadas que generan células hijas del mismo tipo. Sin embargo, en muchos otros tejidos adultos, donde hay constantemente un recambio de células, las nuevas células diferenciadas de reemplazo se generan continuamente a partir de células troncales aparentemente no-diferenciadas. En este punto, conviene mencionar otros ejemplos de tejidos donde esto ocurre. En el intestino, las células troncales no diferenciadas se encuentran en el fondo de las criptas de Lieberkühn. Cuando estas células se diferencian, empiezan a migrar hacia las criptas. Las células muertas son eliminadas al lumen intestinal (Fig.9). En el caso de la epidermis, las células troncales se encuentran en la base del epitelio. Las características de las células troncales son:
1. No se encuentran diferenciadas completamente sino que están destinadas a diferenciarse en un cierto linaje.
2. Tienen un alto grado de proliferación.
3. Cuando se divide, cada célula hija tienen dos opciones: puede permanecer como célula troncal o puede entrar en un proceso que la lleva a diferenciarse de manera terminal e irreversible (Di).
Finalmente, cabe mencionar que se requieren células troncales en los tejidos donde existe una necesidad recurrente de reemplazo de células diferenciadas que no tienen la capacidad de dividirse. En muchos tejidos, la condición de diferenciación completa es incompatible con la división celular. (ej. Tejidos nervioso y muscular).
VOCABULARIO
Es un ejemplo de comunicación entre células, un verdadero diálogo en que las señales de unas células inducen a las otras células a producir otras señales, frente a las cuales responden ahora las primeras células.